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　　N糖酰胺酶FPEPTIDEN4NACETYLΒDGLUCOSAMINYLASPARIGINEAMIDASE；PNGASEF；EC35152能够在温和的条件下从糖肽、糖蛋白上面完整切下N连接的寡糖链N糖苷，将寡糖链和蛋白部分分开。糖酰胺酶F具有广泛的底物专一性，对所有类型的N寡糖链都有作用。这些特性使糖酰胺酶F在糖链结构分析、糖链在生物体内的作用和糖链对糖蛋白的作用的研究中起到了重要的作用。现在商业化的N糖酰胺酶F主要从脑膜炎脓杆菌FLAVOBACTERIUMMENINGOSEPTICUM中提取。提取和纯化N糖酰胺酶F是一个十分耗费和耗时的工作，因此市场价格十分昂贵，这大大限制了N糖酰胺酶的广泛利用和N糖链大规模制备。为了获得大量廉价的N糖酰胺酶F，本论文研究的主要内容为根据目的基因N糖酰胺酶F的CDNA序列设计引物，以FMENINGOSEPTICUM菌株的基因组为模板，进行PCR扩增反应；将所得的DNA片段经双酶切后与载体PYD1质粒进行连接，然后导入大肠杆菌DH5Α，用AMPR筛选阳性克隆并用双酶切和PCR鉴定重组质粒PYD1/PNGASEF。转化酿酒酵母EBY100SACCHAROMYCESCEREVISIAE，N糖酰胺酶F将通过酵母菌的分泌系统和AGA1AGA2融合蛋白自动连接到酵母菌细胞壁上，实现N糖酰胺酶F的表达纯化固定一步化。通过免疫荧光试验证明N糖酰胺酶F已经成功的锚定在EBY100酵母细胞表面。经流式细胞仪FACS检测，N糖酰胺酶F细胞表面锚定率最大达到47％。通过摸索培养和诱导条件的优化试验，发现首先在包含2％葡萄糖的YNBCAA067％YNB；05％CASAMINOACIDS培养基中培养，当菌体浓度达到OD60022时，转接到含有2％半乳糖的YNBCAA培养基中，使OD60008；20℃诱导培养36H离心收集菌体，每升发酵液可获得13G锚定有N糖酰胺酶F的菌体。以糖蛋白RNASEB、IGG、人转铁蛋白为酶反应底物对表面锚定有N糖酰胺酶F酵母细胞进行酶活专一性试验，证明该固定化酶对三种类型的糖蛋白都有作用。以糖蛋白RNASEB为酶反应底物对该固定化酶的最优温度、PH、诱导条件进行测定，确定最优酶反应条件为PH55，温度为37℃，最佳诱导条件36H。为了得到可溶性的N糖酰胺酶F，将N糖酰胺酶F基因重组到PET28A载体上，在大肠杆菌中进行诱导表达，表达量在30％以上。经SDSPAGE电泳检测，在34KD有一条目的带。经NINAT纯化，纯度达到90％以上。实验结果表明我们已经获得了锚定有N糖酰胺酶F的酵母细胞，该固定化的N糖酰胺酶F纯化步骤简便，可重复利用，极大的降低了该酶的生产成本。